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    品質保證 · 通蔚試劑

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    實驗操作視頻

    實驗視頻操作

     實驗步驟:1
    1. 樣品準備
    裂解液(RIPA)準備-----每100 ul RIPA加入1 ul PMSF和1 ul的原釩酸鈉溶液,現配現用。加入PMSF,加入原釩酸鈉溶液。
    組織樣本-----黃豆大小組織剪碎,加入200-300 ul配備好的裂解液,冰上研磨,12000轉離心5 min,取上清。
    貼壁細胞-----6孔板一個孔長滿,加150 ul配備好的裂解液,冰上裂解5-10 min,槍頭吹打,吸取裂解好的樣本,轉入EP管,12000轉離心5 min,取上清。
    懸浮細胞-----細胞轉入離心管,2000轉離心5 min,棄上清,加入PBS清洗,2000轉離心5 min,棄上清,每20 ul體系細胞加入150 ul裂解液,冰上裂解5-10 min,槍頭吹打充分裂解,12000轉離心5 min,取上清。

    2. 蛋白濃度測定
    標準曲線制備
    待檢樣本上樣
    加入顯色劑,室溫避光20-30 min
    酶標儀測定OD值
    計算蛋白上樣量(建議每樣本上樣總蛋白含量為50 μg)

    3. 樣本變性
    每40 μL蛋白,加10 ul的5XSDS 上樣緩沖液
    沸水浴10 min
    -20℃保存

    4. SDS-PAGE膠制備
    灌入分離膠
    無水乙醇壓平
    分離膠完全聚合后,倒出無水乙醇
    雙蒸水沖洗
    濾紙吸干
    加入濃縮膠
    插上梳齒
    濃縮膠完全聚合后取出梳齒

    5. 電泳
    膠固定到電泳槽
    倒入電泳液
    加樣,加marker,
    電泳----80 V恒壓至溴酚藍到濃縮膠與分離膠交界處,改110 V恒壓至溴酚藍到凝膠底部

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